激光共聚焦掃描顯微鏡簡介

一、 激光共聚焦顯微鏡的基本組成
  激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今世界*先進的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦的原理和裝置，以及通過針孔的選擇和PMT的收集，并帶有一套對其所觀察到的對象進行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。
激光共聚焦顯微鏡主要有四部分組成：1、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。2、掃描裝置。3、激光光源。4、檢測系統(tǒng)。整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。
1.1 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)
　　顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成象質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成象質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色 差物鏡，有利于熒光的采集和成象的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺的移動調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計算機自動控制。
1.2 掃描裝置
　　LSCM使用的掃描裝置在生物領(lǐng)域一般為鏡掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖象采集速度大大提高，512×512畫面每秒可達(dá)4幀以上，有利于那些壽命短的離子作熒光測定。掃描系統(tǒng)的工作程序由計算機自動控制。
1.3 激光光源
　　LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。多激光器系統(tǒng)在可見光范圍使用多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長為457nm、488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖綠激光器提供發(fā)射波長為543nm的綠光，氦氖紅激光器發(fā)射波長為633nm的紅光，新的405nm半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線，但是小巧便宜而且維護簡單。
1.4 檢測系統(tǒng)
　　LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng)，一般有三個熒光通道和一個透射光通道，能升級到四個熒光通道，可對物體進行多譜線激光激發(fā)，樣品發(fā)射熒光的探測器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器，可以做光子計數(shù)。PMT前設(shè)置針孔，由計算機軟件調(diào)節(jié)針孔大小，光路中設(shè)有能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要,也有通過光柵或棱鏡分光后進行光譜掃描功能的設(shè)置。
二、激光共聚焦顯微鏡的特點以及在生物領(lǐng)域的應(yīng)用
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點，在對生物樣品的觀察中，激光共聚焦顯微鏡有如下優(yōu)越性：
1、對活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進行連續(xù)掃描，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像。
2、  可以得到比普通熒光顯微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。
3、多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉(zhuǎn)掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。 
4、細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記，單標(biāo)記或多標(biāo)記，檢測細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。
5、熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì)，膜標(biāo)記、**物質(zhì)、**反應(yīng)、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進行同時多重物質(zhì)標(biāo)記，同時觀察； 
6、對細(xì)胞檢測無損傷、**、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性；數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。 
   由于共聚焦顯微鏡的以上優(yōu)點，激光共聚焦顯微鏡在以下研究領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛：
1、細(xì)胞生物學(xué)：
如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡機制；各種細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細(xì)胞和癌細(xì)胞細(xì)胞骨架與核改變之間的關(guān)系；細(xì)胞黏附行為等   
2、生物化學(xué)：
如：酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進行基因的表達(dá)檢測，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準(zhǔn)確。
3、藥理學(xué)：
如：**對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)；**進入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 
4、生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)：
如：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)；動物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細(xì)胞的分化行為；細(xì)胞膜電位的測量.熒光漂白恢復(fù)（FRAP）、熒光漂白丟失（FLIP）的測量等。 
5、遺傳學(xué)和組胚學(xué)：
如：細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷； 
6、神經(jīng)生物學(xué)：
如：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞； 
7、微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：
如：**、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)； 
8、病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：
如：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身**性**的診斷； 
9、**學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)。
如：**熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位；對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時空表達(dá)，熒光能量共轉(zhuǎn)移（FRET）。